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Feb. 2, 2006 Vol.8 No.2 P.9 Copyright |
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Study on simultaneous determination of sugar and nicotine with high performance liquid chromatography
Zhou Yuanqing1,3, Wu
Zhaolu2,3, Hu Zongda3, Shi Yundong1, Shen
Taibo1
(1. Department of Chemistry, Yuxi
Teacher’s College, Yuxi 653100; 2.
Kunming Division of Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese
Academy of Science, Kunming 650223 ;3. Institute of Ecology and Geobotany,
Yunnan University, Kunming 650091 )
Abstract The simultaneous
determination of sugar and nicotine with high performance liquid
chromatography (HPLC) in tobacco was studied. The sugar and nicotine was
extracted from the tobacco samples by ultrasonic oscillation for 30 min
with 45 ml of 5％ acetic acid solution.
Then, the extract was purified by solid extraction with
a Waters Sep-Pak-C18 cartridge. The sugars
and nicotine were separated on a Waters Sugar-Pak-1 (6.5×300 mm) cations
ion exchange column with 0.05 g.L-1 EDTA calcium disodium salt
solution as mobile phase. The sugar was detected with a refractive index
detector and the nicotine was detected with an UV detector. The detection
limit reachs m g/ml level for sugar and ng/ml level for nicotine. The
recoveries of sugars and nicotine were between 97- 102 %. The relative
standard derivations of sugars and nicotine were 1.3-2.2%. This method was
applied to the determination of Sugars and nicotine in tobacco with good
result.
Keywords high performance liquid chromatography,
tobacco, sugar, nicotine
高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定煙草中的糖和煙堿
1,3* ，吳兆錄2,3，胡宗達(dá)3，史云東1，申太波1(1.玉溪師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，云南 玉溪 653100；2.中國(guó)科學(xué)院 西雙版納熱帶植物園，云南 昆明650223；3.云南大學(xué) 生態(tài)學(xué)與地植物學(xué)研究所，云南 昆明 650091)
摘要
研究了用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定煙草樣品中的糖和煙堿的方法。煙草樣品中的糖和煙堿用5%的醋酸超聲振蕩浸取，浸取液用Waters Sep-Pak-C18固相萃取小柱預(yù)分離，然后用0.05 g.L-1的EDTA鈣鈉水溶液為流動(dòng)相， Waters Sugar-Pak-1鈣型陽(yáng)離子交換柱分離，用示差檢測(cè)器檢測(cè)糖，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)煙堿，方法可一次進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定煙草樣品中的蔗糖，麥芽糖，果糖，葡萄糖和煙堿。方法最低檢測(cè)限在微克級(jí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3-2.2 %，標(biāo)準(zhǔn)回收率在97~ 102％之間。方法用于幾種煙草樣品分析，結(jié)果令人滿意。關(guān)鍵詞 高效液相色譜法，煙草，糖，煙堿
糖和煙堿是煙草中最重要的化學(xué)成分，它們?cè)跓煵葜械暮考跋嗷ケ壤龑?duì)煙草質(zhì)量有重要影響，因此煙草中的糖和煙堿的測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)煙草質(zhì)量有重要的意義[1，2]，糖和煙堿的測(cè)定方法有容量法，光度法和色譜法等 [3-6]。但是用高效液相色譜法一次進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定煙草中的糖和煙堿還未見(jiàn)報(bào)道過(guò)。我們研究了用5%的醋酸為浸提劑超聲浸取煙草中的糖和煙堿，用Waters Sugar-Pak-1鈣型陽(yáng)離子交換柱分離，分別用示差檢測(cè)器檢測(cè)糖，紫外檢測(cè)器檢測(cè)煙堿，首次建立了一次進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定煙草中的糖和煙堿的方法。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1主要儀器和試劑
美國(guó)PERKIN-ELMER 公司高效液相色譜儀，包括LC-250泵，LC-30示差折光檢測(cè)器，LC-480紫外二極管矩陣檢測(cè)器，LC-Oven-101柱溫箱；大連化物所KYKY-SPS-II色譜工作站。
水為石英亞沸蒸餾水并用Milli-Q50(美國(guó)Millipore公司)超純水儀處理； EDTA鈣鈉（高效液相色譜專(zhuān)用，Waters公司提供）；蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖、煙堿標(biāo)樣（Fluka公司生產(chǎn)，含量³ 99%）。
1.2色譜條件
色譜柱：Waters
Sugar-Pak-1鈣型陽(yáng)離子交換柱 (6.5´
300 mm)，Waters Sep-Pak-C18固相微萃取小柱；流動(dòng)相為: 0.05 g.L-1 EDTA鈣鈉水溶液，流速為0.5 ml.min-1；柱溫85℃；進(jìn)樣量20 m l，樣品先通過(guò)紫外二級(jí)管矩陣檢測(cè)器，再通過(guò)示差檢測(cè)器。A，B通道同時(shí)采集，糖用示差檢測(cè)器(A通道)記錄的色譜圖定量，煙堿用紫外檢測(cè)器(B通道)記錄的色譜圖定量，紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm。在該條件下示差檢測(cè)器記錄的色譜圖見(jiàn)圖1，紫外檢測(cè)器記錄的色譜圖見(jiàn)圖2。
圖1 示差檢測(cè)器記錄的標(biāo)樣色譜圖和煙草樣品色譜圖 (a煙草樣品，b標(biāo)樣)
1 蔗糖，2 麥芽糖，3 葡萄糖，4果糖
圖2 紫外檢測(cè)器記錄的標(biāo)樣色譜圖和煙草樣品色譜圖 (a煙草樣品，b標(biāo)樣)
1 煙堿
1.3樣品處理
準(zhǔn)確稱(chēng)取煙草樣品0.5克于50 mL的錐型瓶中，加入5%的醋酸45 mL，用超聲波振蕩浸取30 min，過(guò)濾，濾液定容到50 mL，取5 mL通過(guò)活化好的Waters Sep-Park
C18固相萃取小柱，棄去最初的2 ml，收集后面的3 ml用4.5 mm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)樣20 ml分析。
2 結(jié)果與討論
2.1糖和煙堿的提取
根據(jù)文獻(xiàn)[4,6]，煙草中的糖和煙堿可用5%的醋酸提取，用5%的醋酸可使煙草樣品中糖和煙堿完全溶出，又可避免因酸性過(guò)強(qiáng)而造成煙草中的蔗糖和麥芽糖等二糖或多聚糖水解。我們實(shí)驗(yàn)了用超聲浸取和振蕩浸取提取煙草中的糖和煙堿，實(shí)驗(yàn)表明超聲浸取效果優(yōu)于振蕩浸取，0.5
g 的煙樣用5％的醋酸45 mL浸提，用超聲浸取浸取時(shí)間在20 min以上樣品中的糖和煙堿可完全溶出，而用振蕩浸取浸取時(shí)間在60 min左右糖和煙堿才能完全溶出；因此本實(shí)驗(yàn)選擇用45 mL 5%的醋酸超聲浸取30
min提取煙草中的糖和煙堿。煙草樣品醋酸浸取液中除了有糖和煙堿外，還含有其它成分，如多酚、有機(jī)酸，醛類(lèi)，酮類(lèi)等，這些物質(zhì)易附著在柱材料上不被流動(dòng)相洗脫而降低柱效，多酚有強(qiáng)的紫外吸收，會(huì)干擾煙堿的測(cè)定，所以在進(jìn)樣之前要預(yù)分離這些成分。我們采用Sep-Pak
C18固相萃取小柱預(yù)分離，煙草樣品醋酸浸取液通過(guò)C18固相萃取小柱后，幾乎全部的多酚、醛、酮和絕大部分的有機(jī)酸能保留在小柱上，而糖和煙堿不保留；用Waters SPE
真空提取裝置，每次可同時(shí)處理20個(gè)樣，小柱活化和樣品富集的流速均為10 ml.min-1，小柱用 5 ml乙醇活化，再用10 ml 水洗去乙醇，樣品以10 ml.min-1的流速通過(guò)小柱，棄去最初的 2 ml，收集后面的3 ml用4.5 mm濾膜過(guò)濾，取20 ml進(jìn)樣分析，，這樣可分離除去絕大部份的干擾物。
2.2 糖和煙堿的檢測(cè)
由于糖無(wú)紫外吸收，而且在樣品中的含量較高，故本實(shí)驗(yàn)選用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)糖；煙堿在樣品中的含量相對(duì)于糖較低；本實(shí)驗(yàn)用5%的醋酸提取，由于提取液和流動(dòng)相的不一致會(huì)在示差檢測(cè)器上出很大的溶劑峰，煙堿出峰和溶劑峰重疊，因此根據(jù)示差檢測(cè)器記錄的色譜圖不能測(cè)定煙堿；但是煙堿有強(qiáng)烈的紫外吸收，在紫外檢測(cè)器上出很強(qiáng)的信號(hào)，且溶劑中的醋酸紫外吸收很弱，在紫外檢測(cè)器上溶劑峰很小(見(jiàn)圖3)，對(duì)煙堿的干擾可忽略，因此本實(shí)驗(yàn)選用紫外檢測(cè)器檢測(cè)煙堿，在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下煙堿和去甲基煙堿不能分離，因此測(cè)定結(jié)果為煙堿和去甲基煙堿的總和；在273
nm波長(zhǎng)處煙堿和去甲基煙堿有相近的吸收，且在該波長(zhǎng)下溶劑峰小，因此實(shí)驗(yàn)選擇紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為273
nm。
圖3 煙草樣品提取液和溶劑空白在273
nm處的色譜圖
a 煙草樣品提取液，b 煙草樣品提取液用硅鎢酸沉淀除去煙堿，c 5％的醋酸
2.3 流動(dòng)相的選擇
根據(jù)色譜柱說(shuō)明書(shū)，Waters Sugar-Pak1鈣型陽(yáng)離子交換柱一般以水作流動(dòng)相，水中加入少量EDTA鈣鈉可減少柱材料上的鈣離子流失，延長(zhǎng)柱的壽命；流動(dòng)相也可加入少于5％的甲醇，乙晴或四氫呋喃等親水性有機(jī)溶劑。但對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的分離組分，加有機(jī)溶劑對(duì)分離沒(méi)有改善作用。因此實(shí)驗(yàn)選用0.05
g/L EDTA鈣鈉水溶液作流動(dòng)相。
2.4柱溫的選擇
在室溫(18-25℃)下幾種成分不能很好的分離，峰型也比較差，而且色譜柱反壓大，容易損傷色譜柱（離子交換柱的材料最大壓力不能超過(guò)1.38´ 104 KPa，在3.45´ 104 KPa - 4.83
´ 104 KPa之間最好）。柱溫保持在70-90℃之間可使幾種組分得到較好的分離，故實(shí)驗(yàn)控制柱溫為85℃。在室溫下反壓為8.62´ 104
KPa，在85℃時(shí)反壓僅為4.0´ 104 KPa。
2.5回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限
用峰面積外標(biāo)定量法可得各組份的工作曲線；回歸方程為見(jiàn)表1。根據(jù)信燥比S/N=3，測(cè)得個(gè)組分最低檢測(cè)濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。
|
組分 |
回歸方程 |
線性范圍 |
相關(guān)系數(shù) |
最低檢測(cè)濃度 |
RSD% |
|
蔗糖 |
A=159+1.96 ´105 C(mg/ml) |
10-10000 |
r=0.9998 |
1.5 |
1.2 |
|
麥芽糖 |
A=101+1.97 ´105 C(mg/ml) |
10-10000 |
r=0.9999 |
1.5 |
1.3 |
|
葡萄糖 |
A=180+1.77 ´105 C(mg/ml) |
15-10000 |
r=0.9997 |
2.0 |
0.85 |
|
果糖 |
A=167+1.97 ´105 C(mg/ml) |
20-10000 |
r=0.9999 |
2.0 |
1.5 |
|
煙堿 |
A=－175+1.663 ´108 C(mg/ml) |
0.05-180 |
r=0.9998 |
0.008 |
1.8 |
2.6樣品分析結(jié)果
測(cè)定了幾種煙草樣品中的糖和煙堿，結(jié)果見(jiàn)表-2。用煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(自動(dòng)分析儀法)對(duì)樣品中的總糖和總煙堿進(jìn)行了對(duì)照分析，結(jié)果見(jiàn)表-2。從表-2分析結(jié)果可看出，本方法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法分析結(jié)果基本相符，但精密度稍差。
表
2 樣品分析結(jié)果|
組分 |
樣品 (%) |
RSD％(n=5) |
回收率％ (n=5) | |||||
|
大理 (C3F) |
大理 (X2F) |
玉溪 (C3F) |
玉溪 (X2F) |
卷煙 -1 |
卷煙 -2 | |||
|
蔗糖 |
3.23 |
2.52 |
2.82 |
1.76 |
2.16 |
2.12 |
1.6 |
102 |
|
麥芽糖 |
2.93 |
1.62 |
2.43 |
1.62 |
1.58 |
1.82 |
1.5 |
98 |
|
葡萄糖 |
13.5 |
8.23 |
11.8 |
7.26 |
9.69 |
10.6 |
1.3 |
99 |
|
果糖 |
11.6 |
9.12 |
13.2 |
8.31 |
9.71 |
9.36 |
2.2 |
101 |
|
煙堿 |
2.46 |
1.82 |
2.85 |
2.12 |
2.11 |
1.98 |
1.4 |
97 |
|
總糖(自動(dòng)分析儀測(cè)定值) |
32.8 |
22.6 |
31.4 |
19.5 |
24.7 |
24.6 |
0.64 |
101 |
|
煙堿 (自動(dòng)分析儀測(cè)定值) |
2.52 |
1.88 |
2.91 |
2.15 |
2.16 |
2.01 |
0.78 |
99 |
3 結(jié)論
本方法用超聲浸提，固相萃取預(yù)分離，高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定煙草樣品中的糖和煙堿，方法便于樣品批量處理，簡(jiǎn)便快速，用煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(自動(dòng)分析儀法)對(duì)樣品中的總糖和總煙堿進(jìn)行了對(duì)照分析，結(jié)果基本相符，說(shuō)明該方法結(jié)果可靠，該方法的建立為煙草中糖和煙堿的同時(shí)測(cè)定提供了方法。
REFERENCES
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